科大及理大研究人員開發體外囊泡重組實驗 為研究蛋白分泌轉運途徑的分子機制提供新見解

(文章轉載自EurekAlert!,首次刊登於2021年9月7日)

2021-09-09

香港科技大學(科大)及香港理工大學(理大)研究人員開發了體外囊泡重組實驗,並通過結合該實驗途徑及定量質譜分析,發現了囊泡中受特定因子調控被裝入囊泡的特定貨物蛋白,和介導囊泡運輸的新的調控蛋白。該研究成果及實驗途徑,為進一步揭示分泌途徑相關的分子機制提供了重要的新工具。

真核細胞的分泌轉運途徑是一個非常重要的過程。人體內的很多生長因子,荷爾蒙以及其他重要的因子都是通過分泌轉運途徑從細胞中分泌出來,從而履行它們的生理功能。另外很多新合成的蛋白必須通過分泌轉運途徑以被運輸到特定的亞細胞目標位點才能行使其功能。在分泌轉運途徑中承載貨物蛋白的運輸工具是運輸囊泡。就像日常生活中的物流及運輸服務,貨物蛋白是否能夠被運輸到正確的靶向位點,關鍵在於這些貨物蛋白是否被準確分選到特定的運輸囊泡中。若貨物蛋白分選功能缺失,會導致細胞極性建立、免疫功能以及其他生理功能缺陷。

在分泌途徑中,調控蛋白質分選的關鍵參與者包括Arf家族蛋白和貨物適配蛋白(cargo adaptor)。 Arf家族蛋白有20多個成員並且分別定位在特定的亞細胞位點。它們在結合GDP的不活躍狀態和結合GTP的活躍狀態之間循環。結合GTP的Arf 蛋白將胞質中各種貨物適配蛋白招募到細胞膜或特定細胞器的膜上,一旦被招募到膜上,這些貨物適配蛋白就會識別貨物蛋白上的分選信號序列,將貨物蛋白包裝進入囊泡,實現蛋白質的分選。

儘管我們了解了貨物分選的基本步驟原理,但受特定Arf家族成員或特定的貨物適配蛋白調控的貨物蛋白譜在很大程度上仍未得到充分研究。另外,我們也需要系統的實驗途徑以發掘及鑑定被特定的Arf蛋白招募到膜上的胞質蛋白。

在本項研究中,科大生命科學部副教授郭玉松的團隊利用體外囊泡重組實驗重構了將貨物蛋白包裝進囊泡的過程,並且通過生化的方法分離了富集貨物蛋白的囊泡。他們與理大姚鐘平教授的研究團隊合作,通過定量質譜分析分離的囊泡的蛋白質組學。該研究進一步系統地發現了依賴於GTP和囊泡膜結合的胞質蛋白,其中的一個重要胞質蛋白FAM84B與貨物適配蛋白相互作用,並調節跨膜貨物蛋白的運輸。此外,該研究通過體外囊泡重組實驗發現了依賴於GTP水解包裝進囊泡的多個新型貨物蛋白。

Prof. GUO Yusong (third left) and his research team
郭玉松教授(左三)及其研究團隊

接下來,研究團隊利用體外囊泡重組實驗鑑定出了依賴於特定Arf家族蛋白 SAR1A調控從而被招募到囊泡上的胞質蛋白和貨物蛋白。其中的一個胞質蛋白PRRC1會被招募到內質網出口位點,與COPII囊泡內殼蛋白相互作用,介導蛋白從內質網到高爾基體的運輸。它的缺失會使COPII與囊泡膜的結合更為緊密從而影響正常運輸過程。

通過這種方法,該研究還鑑定了COPII囊泡中的貨物蛋白,其中包括兩個貨物受體蛋白SURF4和ERGIC53。團隊隨後用正常細胞和分別敲除了SURF4 或 ERGIC53 的細胞進行囊泡重組實驗,鑑定了通過這兩個貨物受體蛋白所調控分選入囊泡中的特定貨物蛋白。

Diagram demonstrating the vesicle formation assay as a powerful tool to reveal novel mechanistic insights into the secretory pathway
示意圖展示體外囊泡重組實驗,可以作為有力的工具揭示分泌途徑的新的分子機制

這些結果表明,囊泡重組實驗與定量質譜分析相結合是分析囊泡運輸的有力手段,可以系統地揭示依賴於特定蛋白因子包裝進囊泡中的貨物蛋白,分析不同生理條件下囊泡中的蛋白組分,以及鑑定與囊泡膜上特定因子相互作用的胞質蛋白。

郭教授的研究重點之一是分泌途徑中調控貨物蛋白質分選入囊泡的分子機制,他和姚教授為本研究的共同通訊作者。科大博士後研究員黃艷博士、理大的殷海娣博士和香港中文大學的李白穎博士是這項研究的共同第一作者。科大的研究人員劉洋、唐笑、汪末和吳芷曉參與了這項研究。研究結果已獲《美國國家科學院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences)刊載。